从药用植物内生真菌中筛选出一种对频危中药金线莲有明显促进作用的粘帚霉属真菌,并发现真菌丝体提取物有降压活性。为阐明该菌对金线莲的促生作用机制和生理活性物质基础,我们对其化学成分进行了研究,从菌丝体中分离鉴定了5个化合物:8(E)-N-(2′-羟基棕榈酰基)-1-O-β-吡喃葡萄糖基-3-羟基-9-甲基-2-十八氨-4,8-二烯[8(E)-N-(2′hydroxpalmityl)-1-O-β-glycopyranosyl-9-methyl-2-octodecanine-4,8-diene,Ⅰ];N-(2′-羟基-二-十四烷酰基)-1,3,4-三羟基-2-十八氨(N-(2′-hydrox cosanoyl)-1,3,4-trihydroxy-2-octodecanine,Ⅱ);7,22-双烯-3-羟基-6,9-氧桥麦角甾(7,22-diene-3-hy-droxy-6,9-epidioxyerosta,Ⅲ);麦角甾醇(ergostero,Ⅳ)和α-棕榈精(palmitin Ⅴ)。
1 仪器与器材
X-4型熔点仪(未校正),AEI-MS-50型质谱仪,BruckARX 400型核磁共振仪,BIFLFXⅢ型MAL-DI-TOF-MS质谱仪,100~200目粗孔硅胶(青岛海洋化工厂)。菌种为粘帚霉属真菌Gliocladium sp.,由本室提供。
2 发醇培养
平皿转摇瓶培养。培养基:麦麸30g煮汁,葡萄糖20g,K2HPO40.75g,MgSO41.5g,加水至1000ml;种子培养基另加1.8%~2.0%琼脂,装料系数1/3;摇瓶转速140r?min-1;发酵周期8d。共获干燥菌丝体2370g。
3 提取分离
2000g干菌丝体,粉碎,过40目筛。85%乙醇回流5次,浓缩物加水悬浮,石油醚萃取5次,回收石油醚得粗提取物74g(油状)。70g粗物上100~200目粗乳硅胶湿柱(740g),石油醚~石油醚~乙酸乙酯-甲醇(100:100:20)梯度洗脱,每250ml为1份,共收集450份,TLC检测。59~78份CHCl3多次重结晶,得无色针状晶体40mg(Ⅳ);178~186份丙酮重结晶得白色粉末21mg(Ⅴ),313~315份CHCl3,重结晶得白色粉末,CHCl3-MeOH(1:1)重结晶得膜状固体40mg(Ⅱ),母液0~4℃放置1周,析出白色粉末14mg(Ⅲ);402~405份Sephadex LH-20柱色谱脱色,丙酮重结晶得膜状固体27mg(Ⅰ)。
4 结构鉴定
Ⅰ 白色粉末,mp186~189℃,溶于氯仿、甲醇、吡啶等。TOF-MSm/z:750.78(M+Na+):1H NMR(400MHz,pyridine-d5)δ:8.35(1H,d,J=8.7Hz,NH),6.14(1H,dd,J=5,5,15.3Hz,4-H),5.91(1H,m,J=15.3,3.0,5.6 Hz,5-H),5.23(1H,brs,8-H),4.90(1H,d,J=7.7Hz,1″-H),4.80~3.88(11H,O-CH),2.12(4H,brs,6-CH2,7-CH2),1.98(2H,t,J=9.14Hz,10-CH2),1.59(3H,s,19-CH3),2.19~1.22(40H,methylenes),0.83(6H,t,J=6.681-Hz,18-CH3,16′-CH3)。13C NMR(100MHz,pyridine-d5)δ:175.6(C-1′),135.3(C-9),132.3(C-5),131.9(C-4),124.1(C-8),105.7(C-1″),78.6(C-3″),78.4(C-5″),75.1(C-2″),73.5(C-2′),72.3(C-3),71.5(C-4″),70.2(C-1),62.6(C-6″),54.6(C-2),32.1(C-14,16),30.0~25.9(methylenes),22.9(C-15,17),16.1(C-19),14.3(C-16,18)。NMR数据与文献一致,推知为8(E)-N-(2′-羟基棕榈酰基)-1-O-β-吡喃葡萄糖基-3-羟基-9-甲基-2-十八氨-4,8-二烯。
Ⅱ 白色粉末(C42H85O5N),mp145~147℃,溶于吡啶,CHCl3-MeOH(1:1),难溶于:CHCl3,MeOH等。TOF-MS m/z:706.6(M+Na+);EI-MSm/z:456(M-C15H310),384(M-C23H47O),339(C23H47O+)。1HNMR(400MHz,pyridine-d5)δ:8.57(1H,d,J=8.9 Hz,NH),5.11(1H,m,2-H),4.60(1H,dd,J=7.7,3.7Hz,2-H),4.50(1H,dd,J=4.5,10.8 Hz,1-Ha),4.41(1H,dd,J=10.8,5.0Hz,1Hb),4.35(1H,dd,J=4.7,6.5Hz,3-H),4.27(1H,m,4-H),2.22-1.29(64H),0.84(6H,t,J=7.0 Hz,18-CH3):13C NMR(100 MHz,pyridine-d5)δ:175.2(C-1′),76.8(C-4)73.0(C-3)72.4(C-2′),62.0(C-1),53.0(C-2),35.7(C-3′),34.1(C-5),32.1(C-16,22′),30.3~25.8(CH2),22.9(C-17,23′),14.2(C-18,24′)。NMR数据与文献基本一致,推知为N-(2′-羟基-二十四烷酰基)-1,3,4-三羟基-2-十八氨。
Ⅲ 白色粉末(C28H44O2),mp228~230℃,微溶于CHCl3,MeOH等,能溶于:CHCl3-MeOH(1:1)。EI-MS(m/z):412(M+),394(M-H2O),379(M-H2O-CH3),376(M-2H2O),287(M-C9H17),251(M-C9H17-H2O,100%)。1H NMR[400MHz,CDCl3-MeOH-d4(1:1)]δ:5.28(1H,d,J=2.9Hz,22-H),3.98(1H,m,3-H),3.56(1H,dd,J=5.0,2.4 Hz,6-H),1.06(2H,s,19- CH3),1.03(1H,d,J=6.6Hz,21- CH3),0.93(3H,d,J=6.8,Hz,28- CH3),0.85(3H,d,J=6.5Hz,26- CH3),0.83(3H,d,J=6.5 Hz,27- CH3),0.63(3H,s,18- CH3),波谱数据与文献安全一致,推知为7,22-双烯-3-羟基-6,9-氧桥麦角甾。
Ⅳ推知为麦角甾醇。Ⅴ推知为α-棕榈精。
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