人参皂苷根据是否带有达玛烷结构而分为Rbl和Rgl,所以制作了这两类成分的抗体。制作特异性强的单克隆抗体,取数毫克汉方药颗粒剂即可定量。为在野外操作方便,又制作了可以检验Rbl和Rgl的试剂盒。非人参皂苷标本出现斑点,人参皂苷Rbl和Rgl阳性标本不出现斑点,与ELISA法检测结果一致。
尼泊尔人参的结构出现变异,实地调查发现,叶子与蕨类植物相似的喜马拉雅人参相当多,但只在一个地方发现了Rgl含量高的品种,故应尽可能增加这种高含量的种子。用这种方法还可对人参培养进行品种改良,选择含量高的品种。
药典规定芍药的有效成分是芍药苷。制作相应的单克隆抗体能够简单地对方剂中的含量进行定量。如可以同时对芍药甘草汤中2种生药成分进行定量。但对小柴胡汤中的所有生药还不能全部测定,现已制作出柴胡、人参、甘草、黄芩的抗体。如果这些生药能同时定量且不考虑分离条件,则质量管理将会简单易行。
2.3 质量评价方法的改进
能简单评价质量的方法有免疫印迹法、DNA印迹法、萨慎法等。在此介绍新开发的Eastern印迹法 (Eastern blotting protoc01)。首先以薄层色谱法 (TLC)将展开的成分全部转录到PVDF膜上(用加热板加温),因为化合物含有糖基,打开糖基部分加入蛋白质,使其在膜上结合,然后用单克隆抗体显色。将甘草根转录到膜上显色,可得知甘草皂苷的分布。若是其它生药如人参,则因无相应的抗体而不显色,可明确区分甘草与其它生药。
Eastern印迹法与TLC不同,对不同甘草品种的甘草皂苷规格的检测,TLC法不明显而Eastern印迹法非常清晰。给予甘草皂苷后观察大鼠血药浓度的变化,TLC法几乎看不到,而Eastern印迹法显示清晰。 .
柴胡品种多,所含成分殊异,比较其含量表明结构存在差异。分别用Eastern印迹法和TLC法检测柴胡皂苷,前者柴胡提取剂谱带少,含有柴胡的方剂能观察到次生谱带。汉方制剂中柴胡成分可出现柴胡皂苷D、A、B2或C,由此区分是汉方制剂还是提取剂。
以人参皂苷Rbl抗体分析配伍人参的汉方方剂,用Eastern印迹法进行双重染色,制作人参皂苷 Rgl和Rbl对应的2种抗体,标记不同的酶。因其基质不同显色也不同,显红色的是类似于Rgl的达玛烷骨架的物质,绿色的是与Rbl相关的物质。由此可知苷元的骨架结构以及高度(Rf值),并大体了解糖的数目。将两者结合,就可明确生药的质量管理与评价。
2.4 利用基因等技术制造、提取有效成分
研究发现,人参有多种生理活性,人参皂苷Rg3能抑制癌转移,中国已将Rg3研制成抗癌药上市。通过制作抗体柱,利用抗原抗体反应,经过洗涤、洗脱等步骤可以分离提纯或去除生药提取物中的某一成分。欲从人参的多种活性成分中提取某成分做成制剂,必须提高该有效成分含量。目前正研究向植物内加入小型化抗体基因单链Fv,单链Fv是用肽连接VH和VL部分制成的小型抗体,利用该抗体基因使有效成分增产。小型化抗体与原来的单克隆抗体相比具有同样的亲和力和性质。
向植物内加入基因时不能以大肠杆菌原型加入,要变成土壤杆菌。这种菌具有自身产生植物激素,不断生根的性质,因此将大肠杆菌中的基因移到土壤杆菌,使植物感染长出毛状根。经检测,加入基因者较对照物成分含量提高2~3倍。研究表明,毛状根与普通人参的人参皂苷含量相同,可以用此法大量生产所需有效成分。通过基因重组大量获取活性成分,分子育种显得越来越重要,在临床资料、动物试验数据的基础上,运用现代科学技术进行各种药物的研究。